故事在纽约布鲁克林平凡而嘈杂的街区拉开序幕。马力欧与路易吉兄弟俩刚刚倾尽所有积蓄辞去工作,创办了属于自己的独立水管维修事务公司。然而现实并不宽容,家人的质疑、前雇主斯派克的嘲讽,以及首个维修任务中鸡飞狗跳的意外,让两人背负沉重心理压力。当布鲁克林地底主供水管突发严重破裂泄漏、危及整座城市的街道时,心怀抱负的兄弟俩决定孤注一掷前往城市地下深处排除险情。在幽暗盘踞的迷宫水道中,他们发现了一间尘封已久的秘密泵房,以及一根闪烁着奇异翡翠荧光的神秘绿色管道。
在探索管道的过程中,弟弟路易吉率先被强大的气流旋涡吞噬,马力欧奋不顾身冲入施救,两人双双坠入扭曲的时空隧道。然而在气流分叉的断层,兄弟二人被无情拆散——性格懦弱的路易吉坠入了阴森恐怖、被熔岩与骷髅兵统领的暗黑之国边界,险象环生;马力欧则掉落在一座梦幻瑰丽、巨型彩蘑菇林立的仙境之中,巧遇了头戴红斑蘑菇帽、性格热心且富有探险精神的奇诺比奥。得知路易吉坠入残暴的酷霸王领地后,奇诺比奥立即领着马力欧穿过热闹的蘑菇集市,赶往桃子城堡寻求真正的援助。
此时的蘑菇王国正面临灭顶之灾。强大的龟族霸主酷霸王刚刚率领重装浮空堡垒摧毁了冰雪王国,夺走了拥有毁天灭地能量的无敌星。酷霸王企图通过武力威逼桃子公主与其成婚,若遭拒绝便要彻底将蘑菇王国夷为平地。为了抗击强敌,桃子公主决定亲赴丛林王国寻求狂暴猩猩大军的同盟支援。在出发前,公主对毫无实战经验的马力欧进行了一场严苛的变身特训,虽然马力欧一次次从机械升降台上摔落,但他身上永不言弃的坚韧品质赢得了公主的真诚认可。
众人抵达丛林王国后,马力欧在角斗擂台上通过灵活运用猫咪套装艰难战胜了目中无人的大猩猩咚奇刚,终于说服了库朗奇刚国王组建盟军。庞大的卡丁车队在炫目壮观的彩虹之路上呼啸前行,却遭到了酷霸王精锐空军的半路伏击。惨烈的大战中,道路断裂,马力欧与咚奇刚双双跌入深海巨兽的腹中。危急关头两人放下成见协力逃生,并驾驶火箭桶及时赶回了已被酷霸王阴霾笼罩的婚礼仪式现场。
在决战的最后高潮,巨型炸弹引发的时空坍塌将整艘战舰与战场拽回了布鲁克林现实街头。在面对被激怒的残暴酷霸王时,身负重伤的马力欧本已处于绝境,被囚禁脱困的路易吉手持下水道井盖挺身而出,兄弟二人联手在千钧一发之际触碰到了金光璀璨的无敌星。伴随着经典旋律的激昂轰鸣,两人化身无坚不摧的金色光芒横扫敌阵,守护了布鲁克林与蘑菇王国两个世界的平静。